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Fura-2是一种常用的紫外光激发和比率测定型Ca²⁺荧光探针。一旦与Ca²⁺结合后，Fura-2的最大激发波长发生蓝色迁移，由原来的363nm（Ca²⁺-free）迁移到335nm（Ca²⁺-saturated），而最大发射波长基本未变化，保持在510nm左右。通常情况，分别用最大激发波长340nm和380nm来激发Fura-2，且用340/380nm激发下的荧光比值来检测细胞内Ca²⁺浓度。使用比值检测，可消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，探针的渗漏，细胞厚度差异等因素导致的检测误差。Fura-2自1985年合成以来，广泛用于各种细胞系统和生化用途，特别是数字显微成像。单波长检测，Fura-2与Ca²⁺结合后，推荐用最大激发和发射波长分别为340nm和510nm；双波长检测，则推荐用最大激发和发射波长分别为340nm和380nm。

Fura-2,AM是Fura-2的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fura-2，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供，使用时只需经无水DMSO充分溶解，配置成1～5mM的储存液，并稀释到合适的工作浓度即可。进行细胞内Ca²⁺检测，Fura-2,AM的常用浓度为0.5～5μM。

同义名	Fura-2,Acetoxymethyl Ester
CAS号	108964-32-5
分子式	C44H47N3O24
分子量	1001.86
纯度	≥95% (HPLC)
外观	黄色粉末
光谱特性	Ex/Em=363nm/512nm(Ca2+-free)；Ex/Em=335nm/505nm（Ca2+-saturated）
溶解性	溶于DMSO（1～5mM）
结构式

• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• 乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
  
• Fura-2,AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20～25℃温育片刻至全部融解后使用。
  
• Fura-2,AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。
  
• Fura-2,AM具有相对较强的抗光淬灭能力，细胞孵育后1h内观察，都不会因荧光泄露和光漂白作用导致测定结果发生明显变化。
  
• Fura-2不适合用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测，因很难用它们完成激发光谱的快速转换。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127(货号：KM0188)中加入500μL DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40～50℃加热20～30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
  
• HHBS Buffer(1×HBSS with 20mM HEPES buffer,pH7.3)或者其他生理缓冲液。

• 用无水DMSO溶解Fura-2,AM配制成1～5mM的储存液，或将已配好的Fura-2,AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fura-2,AM中加入12.5μL无水DMSO）。准备Fura-2,AM工作液之前，有时需要往Fura-2,AM储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。
  ① Fura-2,AM染色工作液制备前，添加等体积20% Pluronic F-127溶液到Fura-2,AM+DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。
  ② Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。
  
• 用HHBS或其他生理缓冲液将Fura-2,AM+DMSO储存液稀释到0.1～5μM的工作液。
  ① Fura-2,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4～5μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
  ② Fura-2,AM工作液需现配现用，避免反复冻存。
  
• 【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1～2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1～0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。
  ① 丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。
  
• 将准备好的Fura-2,AM染色工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃孵育20～60min。
  ① 若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Fura-2,AM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2～3次。
  ② 关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
  ③ 降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。
  
• 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺酸的缓冲液）清洗细胞1～2次，以去除残留探针。
  
• 37℃再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。
  
• 用荧光显微镜、荧光分光光度计或其他荧光检测设备，根据实验要求选择合适的波长进行检测。